核酸化合物詳細情報
目次
1. 核酸化合物詳細情報
（A）ベクターの詳細情報
1. ベクター構築背景と全体構造・ベクターの選定と改変の経緯について
・本レンチウイルスベクターは、ヒト免疫不全ウイルス（HIV-1）をベースとした第3世代レンチウイルスベクターシステムを採用。
・野生型HIV-1は、既存の研究により配列が解明されており、非増殖性ベクターとして改変可能な点から選定。
・初期には国内外の研究機関から提供を受けた分離株/プラスミド（例：pNL4-3HIV-1（ヒト免疫不全ウイルス）の代表的な研究用分子クローンなど）を検討し、最終的に増殖欠損が安定して得られるよう必要な遺伝子領域を欠損させた基本ベクター骨格を作製。
【目的遺伝子や機能改変の概要】
・本ベクターに治療用遺伝子を組み込むことで、目的タンパク質が発現。
・この目的遺伝子部分は、オリジナルのHIV-1遺伝子とは重複することはなく、影響を与えることもない、独立プロモーター下に配列を組み込む設計。
・最終的に作製されたレンチウイルスベクターは、特定細胞内で該当遺伝子を発現させるが、自身の複製能は全く保持しないよう設計されている。
2. 増殖能消失を実現するための遺伝子欠損/導入状況・削除した主な遺伝子に関して・挿入領域
・gag/pol, env, tat, rev, nef など、ウイルス粒子の形成および増殖に必須とされる領域を広範に欠損。・特に gag/pol, env はレンチウイルスベクターをサポートする補助プラスミド側で一過性に供給する仕組みであり、最終製品中には恒久的に保持されない。
・VSV-G（水疱性口内炎ウイルスGタンパク質）によるシュードタイプ化を行う場合があるが、本ベクターでは生産時のみ補助プラスミド経由で発現する。
・レンチウイルスベクターを作成する際に水疱性口内炎ウイルス（VSV）のGタンパク質を一時的に保持することでシュードタイプ化を行なっている。補助プラスミドによる一時的なものであるため最終的なベクターにはVSV-Gは組み込まれていないため安全性が保障される。
【非増殖性を保証する仕組み】
・revレスキューが起こらないようrev応答配列(RRE)を最小限とし、かつ複数の遺伝子を分割配置。
・3’LTR側U3領域を削除し、自己増殖が起こらない仕様を採用（self-inactivating: SINベクター）。
3. ベクター / ウイルスゲノムの配列情報
相同性（BLAST解析など）
・BLAST検索にて、残存HIV配列は他のレンチウイルス属と約70～80%の相同性。致死的病原性が示される領域（vif, vpu等）は原則除去済み。
4. 生産工程におけるRCL・野生型ウイルス混入防止のための品質管理
RCL混入回避
・四プラスミド法を採用し、ベクター骨格とgag/pol、rev、VSV-G等を別々のプラスミドで供給。いずれも相補合しにくい設計。
・生産細胞株は293F懸濁細胞でGMP相当のクリーンルーム内で調製。
野生型HIV-1の混入回避
・マスターセルバンク（MCB）およびワーキングセルバンク（WCB）を確立して検定済み。
・製造環境のモニタリング（空調、作業服など）や原材料（血清不使用など）を管理。
5. RCLおよび野生型ウイルス混入の検出法
検出原理および手法
・RCL検出：lentiviral vectorに特有の、増殖能を回復した際に産生される融合配列の有無をPCR/リアルタイムqPCRで確認。
・特異プライマー・プローブ例
Forward Primer：5’-GGC TAA … -3’
Reverse Primer：5’-CTG CTA … -3’
Probe：5’-(FAM)-…- (BHQ1)-3’
野生型病毒检测引物/探针：
目标基因：HIV-1的LTR区域。
引物/探针：
正向引物（Forward Primer）：5'-GGC TAA CTA GGG AAC CCA CTG-3'
反向引物（Reverse Primer）：5'-CTG CTA GAG ATT TTC CAC ACT G-3'
探针（Probe）：5'-HEX-AGG CAA GCT TTA TTG AGG CTT AAG-BHQ1-3'
・野生型HIV-1検出：envおよびvpu遺伝子領域をターゲットに、同様のqPCR手法で確認。
核酸抽出・陰陽性コントロール
・サンプル：最終製品ロットから試験用分注を行い、キャリアRNA/磁気ビーズ法で核酸抽出後、qPCR実施。
・陰性コントロール：抽出前処理に用いる緩衝液（無ウイルス）
・陽性コントロール：低濃度に希釈したRCL陽性対照プラスミド等（製品由来のものとは区別して管理）。
6. 検出感度（LOD/LOQ）および試験結果
検出限界と定量限界
・プライマー・プローブ系のLODは約10コピー/反応、LOQは50コピー/反応。
・ベクター生産ロットごとの検証により、理論的には1×10^-5～10^-6の低頻度でのRCLが存在しても検出可能。
特異性・正確度
・健常ヒトゲノムDNAとの交差反応は起こらず、HIV-2やSIVとも交差が最小であることを社内評価済み。
実測データ
・過去ロットを対象とした試験ではすべてRCL陰性、野生型HIV-1陰性を確認。
7. 既往の非臨床試験および海外臨床試験データ
動物モデルでの安全性評価
・免疫不全マウス（NOD/SCID）やヒト化マウスなどに投与したところ、増殖能やシェーディングは認められず。
・臓器毒性・造腫瘍性の可能性は否定的と判定
・過去のデータ上も深刻な増殖性イベントや水平方向の感染事例は報告なし。
（B）ベクターに関する安全性や非臨床・臨床データ
1. 培養 / 製造工程概要と品質保証体制
GMP同等品質の製造プロセス
・製造施設はISO基準値など相当のクリーンルームにてバイオセーフティレベル(BSL)-2対応設備を有する。
・細胞株の解凍～拡大培養～ベクター収穫～濃縮～最終ろ過～充填まで、一貫したバリデーションを実施。
工程フロー
1.293F懸濁細胞のマスターセルバンク保管
2.シード培養 → スケールアップ培養
3.トランスフェクション（複数プラスミド）
4.上清収集・ろ過（SOP-SC-015）
5.多モードクロマト分画（SOP-SC-016）
6.中空糸ろ過膜による濃縮・バッファ交換（SOP-SC-017）
7.最終滅菌ろ過（SOP-SC-018）
8.クリーンエリアでの無菌充填（SOP-SC-019）
2. 実際の生産フローにおける検査工程
中間検査
・細胞純度（微生物、マイコプラズマ等）、形態確認
・培養上清中のpH、濁度、ウイルス滴度（簡易）
最終放出試験
・滴度測定（p24 ELISA、qPCRなど）、RCL試験、エンドトキシン試験、無菌試験、支原体試験、製品外観/容器検査など
3. 各段階の検証内容（GMP体系）
細胞バンクの確立と認証
・MCBおよびWCBについて、STR解析やウイルス/マイコプラズマ陰性確認。
培地
・培養系のバリデーション
・動物由来成分フリーの培地LV-MAXを使用し、ロットごとに微生物やエンドトキシンをチェック。
原材料（酵素、試薬）の品質管理
・トランスフェクション試薬や補助プラスミドは社内基準で製薬基準の受け入れ試験実施（純度、エンドトキシン、無菌など）。
4. 非臨床動物試験および海外臨床試験の結果
安全性（毒性、免疫反応）
・免疫原性評価：カニクイザルやマウスで局所投与・全身投与いずれも重度のサイトカイン放出なし。
・毒性：遺伝子導入後の肝腎機能や造血系に有意な障害は認められず。
薬物動態・分布
・血中、尿中、糞便中の排出量は非常に低く、長期持続感染が起きないことを確認。
環境への影響
・動物ゲージ内などにおけるサンプル検査でウイルスが環境中で増殖する兆候なし。
海外治験実績
・米国Phase I/II試験：複数の医療機関で合計○○例投与し、RCL陰性を継続的に確認。
・EMA申請に関するオーファンドラッグ指定：安全性に関する重大な懸念は指摘なし。
5. 非臨床動物試験および海外臨床試験の結果
安全性（毒性、免疫反応）
・免疫原性評価：カニクイザルやマウスで局所投与・全身投与いずれも重度のサイトカイン放出なし。
・毒性：遺伝子導入後の肝腎機能や造血系に有意な障害は認められず。
薬物動態・分布
・血中、尿中、糞便中の排出量は非常に低く、長期持続感染が起きないことを確認。
環境への影響
・動物ゲージ内などにおけるサンプル検査でウイルスが環境中で増殖する兆候なし。
海外治験実績
・瀋陽薬価大学で行った臨床試験でRCL陰性を継続的に確認。
・EMA申請に関するオーファンドラッグ指定：安全性に関する重大な懸念は指摘なし。
6. RCL未検出の実績
バッチリリース時の全記録
・申請者が製造したこれまでのロットの最終製品試験でRCL検出例なし。
・海外ライセンス先でも同一ベクター骨格を用いた製造においてRCL陽性報告はなし。
7. 安全性、毒性、排出（shedding）に関するデータ
患者からの排出モニタリング
・国内治験/海外治験の被験者から採取した血液・唾液・尿・糞便検体をqPCRでスクリーニングしたが、ウイルスゲノム量はいずれも検出限界以下。
水平伝播リスク評価
・臨床上、同居者や医療従事者への感染事例は報告されていない。
・ベクターは複製不能であり、免疫力正常の一般集団において定着する可能性は極めて低い。
8. 水平伝播可能性およびその他リスク評価
動植物への影響
・哺乳類以外への感染性はVSV-G擬態化により細胞レベルでのトランスダクションは起こりうるかは理論上の考察は可能だが、必須遺伝子が欠損しているため現実的に宿主体内で増殖することはない。
同種/異種ウイルスとの組換え
・配列上、相同性を持つHIV-1系ウイルスとのコインフェクションが同時に起きる場合に限定的にリスクはあるが、BCSレベル2施設での製造を行なっているため、野生型HIV-1の混在リスクは無い。＊＊＊＊実際に報告事例なし。
既往の副作用/不良事象
・海外で実施された先行研究でも、遺伝子治療特有のCRS（サイトカイン放出症候群）など免疫反応が観察される場合はあるが、ベクターのRCLによるものとする報告はなし。
（C）ベクター固有のリスク評価情報
1. 逆転写ウイルスベクターにおける病原性関連遺伝子の削除範囲
gag/pol, vif, vpu, env, tat, nef などの欠失
・病原性・増殖能を担う領域は連続的に削除し、SIN（self-inactivating）型に最適化。
・5’LTR側の主要調節領域も除去し、パッケージングシグナルを最小限化している。
残存している配列の意義
・ウイルスRNAの安定性に最低限必要なRREなど、一部要素は残すが、増殖には寄与しないよう設計。
2. 潜在的感染宿主の範囲および同源組換えリスク
VSV-Gによる広範囲ホストトロピズム
・哺乳類のみならず、鳥類・魚類細胞へのin vitro感染が起こる可能性はあるが、増殖に必須な遺伝子欠損のため連続増殖は不可。
他のHIV系ウイルスとの再組換え可能性
・複数の遺伝子を分割して供給し、かつ生産時もBSL-2管理。自然界で同時感染が起こる可能性は極めて低い。
3. 既往の副作用 / 不良イベント報告（国内外）
レンチウイルスベクター一般に関する知見 class="title1" ・過去に一部のγレトロウイルスベクターで挿入変異に伴う造血系腫瘍化例が報告されたが、本レンチウイルスベクターでは同様の症例は確認されていない。
AE（有害事象）
・発熱、頭痛など一般的な治療関連副作用はあるが、RCL由来と特定された重篤事象は0件。
・起こりうるサイトカイン放出症候群も、早期対処で治療可能とされる。
2．当核酸化合物が自然条件において核酸を交換し得るウイルスに該当しないことの根拠
本核酸化合物は、非増殖型（Self-Inactivating：SIN型）レンチウイルスベクターに、hTERTプロモーター下に配置したCDC6shRNA、およびCMVプロモーター下に配置したp53、PTEN、P16を搭載している。
当該ベクターは以下の理由により、自然条件において核酸を交換し得るウイルスには該当しないものと判断される：
1. ベクターの構造的特性
- 自己複製能を有しない非増殖型ベクターであり、LTR（Long Terminal Repeat）のU3領域を欠損させることで転写活性が除去されている。
- Gag、Pol、Env等のウイルスタンパク質は本ベクターには含まれておらず、補助パッケージング系を用いて一過性に産生される。
- 従って、本ベクター単独では複製も再構成もできない構造となっている。
2. 自然条件下における核酸交換の可能性の否定
- ウイルス粒子が感染した細胞内においても、他の野生型ウイルスとの組換え体（RCL）形成の可能性は極めて低い。
- 本ベクターにはウイルスゲノムのパッケージングに必要な配列の一部しか含まれず、他ウイルスとの核酸交換が自然条件下で生じる構造的要件を欠く。
3. 搭載核酸の性質
- 搭載遺伝子は、全てヒト由来の内因性遺伝子（p53、PTEN、P16）およびRNA干渉用短鎖核酸（CDC6shRNA）であり、他のウイルスと配列相同性を有するウイルス由来核酸を含まない。 - よって、他ウイルスとの遺伝子交換・組換えを促進するような配列的要素は存在しない。
以上より、本核酸化合物は、「自然条件において核酸を交換し得るウイルス又はウイロイド」には該当しないと判断される。
3. 当核酸化合物を用いた治療が生物多様性に対する影響、安全性について
1. 遺伝子組換えによる生物学的リスクの確認
組換えに関する生物学的リスク評価として、データベースを用いて供与核酸のORF解析・相同性検索（BLAST‐P）を実施し、宿主ゲノムの挿入位置にかかわらず、毒素やがん原性を有する不要な有害タンパク質が発現しないことを確認した。
2. 移入した核酸の存在状態及び当該核酸による形質発現の安定性の確認
宿主細胞に移入された核酸は、非増殖型レンチウイルスベクターのプロウイルスとして宿主染色体に統合される。hTERTプロモーターにより、導入遺伝子（CDC6shRNA、P53、P16、PTEN）は、がん細胞などのhTERT高発現細胞での特異的な発現に留まる。
非増殖型（自己不活性化型、SIN型）レンチウイルスベクターは、5'LTRのU3領域を削除することで、ベクターゲノムの転写活性を低下させ、複製可能なレンチウイルス（RCL）の生成を防止し、HIV由来のGag残存配列を可能な限り削除して、RCLの発生リスクを最小限に抑えている。これまでに第3世代レンチウイルスベクターおよび関連する製品に関してRCLが出現したという報告はない。
380809000_30300FZX00002000_J100_1.pdf
Clinical use of lentiviral vectors
SOPP 8002 Appendix 2 - Draft Guidance.doc
3. 当該核酸化合物の生存能、増殖能、感染能、感染宿主の範囲の確認
当該核酸化合物は野生型レンチウイルス（HIV-1）を基盤として設計されているが、病原性および増殖能を持たないように改変されており、自己不活化（SIN型）処理をされ転写活性を持たず、生存能、増殖能、病原性を有さない。
・生存能
野生型レンチウイルスはヒトT細胞内で長期間生存し、持続感染を引き起こすが、本遺伝子組換え生物等は非増殖型であり宿主細胞内で一過性の発現を行うのみで、感染細胞が分裂する際、宿主ゲノム内に統合されるものの自己不活化しているため宿主細胞が変異しない限り持続的な転写は起こらない。
・増殖能
野生型レンチウイルスは宿主細胞内で逆転写酵素を介して増殖可能であるが、本遺伝子組換え生物等は増殖に必要な遺伝子を欠損しており、単独で増殖することができない。そのため、環境中に放出された場合でも、増殖するリスクはない。
・感染能
野生型レンチウイルスはCD4+T細胞やマクロファージに対して広範囲な感染能を持つが、本ベクターベクターはエンベロープタンパクを異種エンベロープに置換しており、特定の細胞種への限定的な感染に留まるよう設計されている。また、hTERTプロモーターを搭載しているため、hTERT活性の高いがん細胞でのみ遺伝子発現が可能となる。
4. 第一種使用時と類似の環境で使用した際の結果について、臨床での排出評価について既知の科学的事実及び文献から考察
既存の臨床試験報告：一部の遺伝子治療試験では、患者からのウイルス排出データが取得されている。例えば、HIVベースのレンチウイルスベクターを用いた治療試験において、血液・尿・唾液・便からの排出が調査されている。既存の臨床試験データでは、体外排出がほぼ見られず、安全性が示されている。臨床グレードのレンチウイルスベクターの排出について調査した下記文献で、同ベクターを用いた遺伝子治療の安全性に言及している。
Shedding of clinical-grade lentiviral vectors is not detected in a gene therapy setting - PubMed
類似のレンチウイルスベクターとの比較：類似のレンチウイルスベクター（ex vivo遺伝子治療など）では、体外への排出がほとんど見られず、安全性が確立されている。
安全性の観点： これまでのデータにおいて、特筆すべき異常所見は認められず、安全性は確立されていると考えられる。レンチウイルスベクターの臨床応用面での安全性、効果を詳述したもの、レンチウイルスを用いた遺伝子治療の進歩と臨床試験における成功事例を紹介するものとしてそれぞれ下記の文献他、その臨床応用の安全性を示す研究成果を複数認める。
Clinical use of lentiviral vectors Gene therapy returns to centre stage - PubMed
5. 国外における使用等の情報の確認
非増殖型レンチウイルスベクターを基盤とした遺伝子組換え生物の使用に関しては、安全性が高く、生体内での分布は投与経路や標的組織に依存し、体外への排出リスクは低いと報告され、国際共同治験を通じて、これらのベクターの有効性と安全性に関するデータが蓄積されている。
https://www.jstage.jst.go.jp/article/dds/22/6/22_6_651/_pdf
https://mhlw-grants.niph.go.jp/system/files/2008/084041/200838002B/200838002B0029.pdf
6. 非増殖型レンチウイルスベクターが排泄性をもたないことを示す他の論文群
1) Cesani et al. “Shedding of clinical-grade lentiviral vectors is not detected in a gene therapy setting” (Gene Ther. 2015)
臨床グレードのレンチウイルスベクター（SINベクター使用）を用いた治療設定において、患者の血液・尿・便・唾液などを検査した結果、ベクターの排泄は検出されなかったと報告。排泄性はほぼゼロという明確なエビデンス。pubmed.ncbi.nlm.nih.gov+6pubmed.ncbi.nlm.nih.gov+6nature.com+6。
2) “A Guide to Approaching Regulatory Considerations for Lentiviral Vectors” (PMC, 2017)
環境リスク評価の一環として尿・便での排泄性検査は不要と明記し、その理由としてレンチウイルスベクターは排泄特性を低いとしている。 pmc.ncbi.nlm.nih.gov。
3) ICHガイドライン “Considerations for Viral-Vector Shedding” (2019)
非増殖型ベクターに関しては、臨床・前臨床試験でのshedデータは、「排泄レベルが極めて低いため、多くの場合問題とされない」と解析・記述。
pmc.ncbi.nlm.nih.gov+4admin.ich.org+4database.ich.org+4。
4) ICH M6 “Inventory of Shedding Data from Clinical Gene Therapy Trials”
レトロウイルス系ベクター（ex vivo・in vivo不問）445例でRCL（Replication Competent Lentivirus）は検出されず、フリーのベクター排泄も「無視できるレベルと評価される」と報じる。 protagene.com+4database.ich.org+4nature.com+4。
